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研究揭示Cas9切割DNA及其被AcrIIC3抑制的分子机理

分类:公司新闻 作者: 来源: 发布:2019-11-06 21:53
  

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  CRISPR/Cas体系是广泛存在于细菌和古菌中反抗病毒、质粒等外源核酸的获得性免疫体系。II型的Cas9在RNA的介导下能够特异性辨认、切开dsDNA,具有可修改性,因而被广泛用作基因修改东西。因为其重要性,Cas9被体系地研讨,很多的文献报导了Cas9的原子分辨率结构、单分子丈量成果、分子动力学模仿计算成果,说明晰Cas9切开DNA的分子机理。可是,之前宣布的Cas9结构中,切开意图DNA的HNH催化口袋远离切开位点,Cas9处于非活性的状况。而活性状况下的结构是真实了解Cas9切开DNA的效果机制所必需的。别的,现在被广泛运用的SpyCas9,因受其巨细的约束,很难与sgRNA一同经过单一AAV病毒导入。而近年来新判定的NmeCas9则因为其相对比较小和脱靶率低的原因,有望成为一个更好的修改东西,但其分子机制尚未被提醒。

  噬菌体编码的具有按捺CRISPR-Cas体系功用的蛋白被称为anti-CRISPR蛋白,这些蛋白能够作为基因修改开关,调控Cas9的活性。2016年,多伦多大学Karen Maxwell课题组初次报导了AcrIIC1、AcrIIC2和AcrIIC3三种能够按捺NmeCas9的anti-CRISPR蛋白。王美丽课题组曾与Maxwell课题组协作说明晰AcrIIC2经过阻止Cas9与sgRNA的结合按捺Cas9活性的机制;可是现在AcrIIC3的按捺机理还不清楚。

  10月24日,中国科学院生物物理研讨所王美丽课题组的研讨论文“Structures of Neisseria meningitidis Cas9 Complexes in Catalytically Poised and Anti-CRISPR Inhibited States”在Molecular Cell 杂志在线宣布。该作业报导了NmeCas9的五种不同的状况:sgRNA结合状况、种子区域配对状况、催化前状况、催化状况、切开后产品结合状况的高分辨率结构。这些结构好像电影相同,逐渐展现了Cas9切开意图DNA的每一个进程,一起提醒了两种不同的NmeCas9辨认两种不同PAM的分子机制,进一步提醒了Cas9切开DNA的分子机制。一起,该作业还报导了AcrIIC3别离与sgRNA结合状况、DNA结合状况Nme1Cas9的复合物结构,提醒了AcrIIC3按捺Nme1Cas9切开活性的分子机理。

  Cas9与sgRNA结合构成功用复合物,然后Cas9-sgRNA复合物读取方针DNA的PAM序列,解开意图DNA双螺旋,一起sgRNA和意图DNA配对,发生R-loop,随后Cas9的HNH与RuvC活性中心别离堵截DNA的两条链。该研讨中的种子区域配对状况的结构,成功捕捉到双螺旋构成的中心进程,即sgRNA辨认、结合意图DNA的状况(图1A)。更值得注意的是研讨者解析了Cas9 HNH处于催化状况的结构(图1B),并第一次观察到金属离子与HNH活性中心的结合。而上述这两种状况是初次被观测到。

  Cas9的HNH结构域具有十分高的柔性,并倾向处于远离切开位点的部位,使得Cas9易处于非活性状况。研讨者对HNH结构域进行改造,增强了HNH结构域与意图DNA的相互效果,提高了NmeCas9切开DNA的活性。一起,HNH的催化状况激活RuvC切开另一DNA链的活性。因而,HNH结构域改造后的Cas9切开意图DNA两条链的活性一起得到增强。

  为了说明AcrIIC3按捺NmeCas9活性的分子机理,研讨者解析了AcrIIC3和结合sgRNA的NmeCas9构成复合物的结构,以及和结合了sgRNA、DNA的NmeCas9构成复合物的结构。研讨标明,两个AcrIIC3单体衔接两个NmeCas9复合物(图1C)。AcrIIC3与NmeCas9之间的相互效果将HNH结构域锚定在非活性状况,然后按捺NmeCas9对DNA的切开。

  这项作业还给我们展现了两种NmeCas9切开DNA的中心状况以及产品结合状况,进一步论述了Cas9切开DNA的分子机理。需求指出的是,在论文评定进程中,Nature Structural & Molecular Biology 杂志报导了处于切开后状况的SpyCas9三元复合物结构,全体分辨率3.37angstrom,可是部分的HNH分辨率比较低。王美丽组报导的催化状况中Cas9三元复合物结构的分辨率更高,为Cas9的改造与使用供给了更有力的理论基础;一起提醒了AcrIIC3按捺NmeCas9切开双链DNA的分子机理。

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